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武漢科銳諾生物科技有限公司
主營：外泌體,透射電鏡,掃描電鏡,石蠟切片等技術(shù)服務(wù)
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滴加FITC-TSA：滴加FITC-TSA試劑，避光室溫反應(yīng)5min。后TBST洗3次×10min，PBS洗1次×5min。
DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片1劑封片。
鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FAM(488)綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光。）
原位雜交雜交液注意事項：
（1）雜交液內(nèi)除含一定濃度的標記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血1清白蛋白及載體DNA或RNA等。
（2）雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。，所以雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達到提高雜交率的目的（尤其對雙鏈核酸探針）。
在雜交液中加入牛血1清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，以減低背景。
熒光原位雜交技（fish）原理：是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位。
熒光原位雜交技（fish）實驗步驟：
1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。
2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。
3、切片：石蠟經(jīng)切片機切片，tunel檢測技術(shù)服務(wù)，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。
4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-無水乙醇Ⅰ 5min-無水乙醇Ⅱ 5min，風干，DEPC水浸泡。
5、消化：根據(jù)組織固定時間長短，切片于修復(fù)液中煮沸10分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。
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第2年
